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[交流分享] 酶聯免疫吸附檢測法測定植物激素含量

發布時間: 2016-06-22  點擊次數: 480次

        [交流分享] 酶聯免疫吸附檢測法(ELISA)測定植物激素含量

一、原理
    植物激素(planthormone)免疫定量主要有放射免疫分析(RIA)和酶聯吸附免疫分析(ELISA),由于前者操作上欠安全等原因,目前常采用后一種類型。在ELISA中,抗原抗體反應的檢測依靠酶標記物來實現,常用的酶有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酯酶。酶可直接標記激素分子,稱為酶標植物激素,也可標記于第二抗體(識別抗激素抗體Fc片段的抗體或金黃色葡萄球菌A蛋白),稱為酶標二抗。這兩類標記物分別用于固相抗體型和固相抗原型ELISA。A.固相抗體型ELISA:將抗激素的單克隆抗體(Mab)與已吸附于固相載體上的兔抗鼠Ig抗體(RAMIG)結合,然后加入激素標準品或待測樣品,使其與固相化的Mab結合, 再加入辣根過氧化物酶(HRP)標記激素(酶標激素)。通過測定酶標激素的被結合量,可換算出未知樣品中激素的數量。B.固相抗原型ELISA:將“激素-蛋白”復合物(該蛋白應不同于免疫原中的載體蛋白)包被于固相載體,加入待測激素(樣品或標準品)和抗IAA多克隆抗體(Pab)反應,進行競爭反應。然后讓HRP標記羊抗兔Ig抗體(HRP-GARIG)與結合在固相上的Pab反應,通過測定與固相結合的酶量,換算出未知樣品中激素的含量。
二、材料、儀器設備及試劑 

(一)材料:高等植物、真菌、藻類等組織或器官。

(二)儀器設備:1. 酶聯免疫檢測儀;2. 高速冷凍離心機;3. 恒溫箱;4. 連續進樣器;5. 渦旋儀;6. 96孔微孔板;7. 離心管;8. 研缽或勻漿器;9. 試管。
(三)試劑1. 洗滌緩沖液:0.01mol/L pH7.4磷酸緩沖液(PBS),含0.05%Tween-0;2. RAMIG溶液,或“激素-蛋白”復合物;3. 0.1%封閉蛋白(該蛋白應不同于免疫原中的載體蛋白);4. 抗激素Mab,或Pab;5. 激素標準品母液,及參比系列溶液(按雙倍或四倍系列稀釋);6. HRP標記激素,或HRP-GARIG;7. 鄰苯二胺(OPD)基質液:5mgOPD溶于12.5ml0.01mol/L pH5.0PBS,用前加入30%H2O212.5μl。

 三、實驗步驟 
    固相抗體型ELISA。
    1. 用方陣法滴定選擇各反應物zui適工作濃度;
    2. 將100μlRAMIG溶液包被聚苯乙烯反應板微孔,4℃濕盒,12h;
    3. 棄去孔內溶液,用洗滌緩沖液洗滌3次,甩干;
    4. 加入100μl抗激素Mab溶液,37℃70min;
    5. 棄去孔內溶液,用洗滌緩沖液洗滌3次,甩干;
    6. 各孔內依次加入50μl待測樣液,每個樣品3次重復,15~20℃,20min;
    7. 加入50μlHRP標記激素,37℃,60min;
    8. 棄去孔內溶液,用洗滌緩沖液洗滌3次,甩干;
    9. 加入100μlOPD基質液,37℃顯色15~20min,加入50μl 3mol/L H2SO4中止反應。用酶聯免疫檢測儀測定490nm下各孔的A490值,求出每份樣品重復孔的平均值。
    10. 用激素標準母液和參比系列溶液,在同一微孔板上同上法操作。 
    固相抗原型ELISA。
    1. 用主陣法滴定選擇各反應物zui適工作濃度;
    2. 將100μl“激素-蛋白”復合物溶液包被于微孔板,37℃,12h;
    3. 棄去孔內溶液,用洗滌緩沖液洗滌3次,甩干;
    4. 加入100μl0.1%封閉蛋白溶液封閉,37℃,30min;
    5. 棄去孔內溶液,用洗滌緩沖液洗滌3次,甩干;
    6. 各孔同時加入50μl樣液和50μl抗激素Pab溶液,以加入正常兔血清溶液的孔(非特異吸附孔)為空白調零,37℃,60min;
    7. 棄去孔內溶液,用洗滌緩沖液洗滌3次,甩干;
    8. 加入100μlHRP-GARIG溶液,37℃,60min;
    9. 棄去孔內溶液,用洗滌緩沖液洗滌3次,甩干;
    10. 隨后的顯色、中止與比色程序同上;11.用激素標準參比系列溶液,在同一微孔板上同上法操作。 

四、結果計算 
    固相抗體型ELISA。
    1. 加入激素母液的的孔(非特異吸附孔)為空白調零,以加入不含激素的PBS的孔為B0孔,以加入激素標準參考系列溶液的各孔為Bi孔。以標準激素摩爾數的常用對數log[激素]為橫坐標(X),對應的ln[Bi/(Bo-Bi)]為縱坐標(Y),可得一條Y=a+bX直線;
    2. 將樣品孔的A490值代入上式,換算出待測樣品中激素摩爾數量,乘以稀釋倍數,除以樣品重量,即為每克樣品的激素含量。 
    
     固相抗原型ELISA以加入不含激素的磷酸緩沖液的孔為Bo孔,以加入激素標準參考系列溶液的各孔為Bi孔。標準曲線計算與結果分析同上。


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