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酶聯免疫技術:乳中孕酮的酶聯免疫測定

發布時間: 2016-07-12  點擊次數: 483次

一、實驗目的

上海勁馬生物本章通過對乳汁中孕酮含量的測定,了解酶聯免疫吸附分析法(Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay,ELISA)的基本原理與檢測技術。讓同學們更加熟悉孕酮的ELISA檢測方式。感謝您對我司的支持與信賴。

與RIA法相似,利用被測抗原與酶標記抗原對特異性抗體進行競爭結合,測試(加入的)標記在抗原上的酶催化底物所產生的顏色反應。當特異性抗體量一定時,且小于被測和標記抗原時,未標記抗原濃度越高,標記抗原和抗體的結合就越受到抑制,顯色愈淺。顯色的深淺與酶量呈正相關,而與樣品中抗原含量呈負相關。

 以標準抗原不同濃度為橫坐標,以比色的光密度值(OD)或相應的結合率(OD/ODo%)為縱坐標,繪制標準曲線。根據被檢樣品的結合率在標準曲線上可查到相應的含量。

目前人們還可以使一些小分子的類固醇激素(如孕酮)與大的蛋白質分子(如牛血清蛋白)結合,成為完全抗原,并按免疫學原理獲得抗體。通過檢測酶標記該完全抗原的競爭性結合率,來測定該激素的含量。

二、實驗動物

奶牛

三、實驗試劑

faqing牛鮮奶

試劑配制:

1、孕酮抗血清 用11α-孕酮-牛血清白蛋白(11α-P4-BSA),免疫兔子所得,效價在1:104以上。

2、標準孕酮 用脫激素奶將標準孕酮稀釋為一系列不同的濃度,如0.125,0.25,0.5,1,2,4,8,16 pg·ul-1。

3、酶標孕酮(即孕酮-辣根過氧化物酶結合物(P-HRP)) 由11α-孕酮-半琥珀酸(11α-P-HS)和辣根過氧化物酶(HRP),通過共價鍵連結而成,稀釋度大于1:106以上。

4、包被緩沖液(pH 9.6,0.05 mo1·L-1碳酸緩沖液),用于稀釋抗血清。

Na2CO3 1.59 g ; NaHCO2.93 g

NaN0.2 g ; 溶于1000 m1蒸餾水中。

5、測定緩沖液(pH7.0,0.1 mo1·L-1磷酸緩沖液,其中含0.87%NaCl和0.1%牛血清蛋白(BSA) 用于酶標抗原及樣品的稀釋。

Na2HP0·12H2O 21.85 g, NaCl 8.70 g

NaH2P04·2H 2O 6.08 g, BSA 1.00 g

溶于1000 m1蒸餾水中。

6、底物緩沖液(pH 5.4磷酸鹽-檸檬酸緩沖液) 用于底物液的配制。

檸檬酸(C6H8O7·H2O) 0.47 g, Na2HP04·12H2O 2.00 g

溶于100 m1蒸餾水中。

7、底物 用于顯色。

取10 mg·m1-1四甲基聯苯胺硫酸鹽(TMBS)或二甲亞礬液(DMSO) 0.2 ml,加入底物緩沖液至5 ml,使用前加50 ul 0.6%的H202。

8、終止液(2 mol·L-1H2SO4溶液) 用于終止顯色反應。

濃H2SO4 1份, 蒸餾水 9份。

9、沖洗液(含0.0 5%吐溫(Tween)20,pH 7.4的磷酸緩沖液) 用于沖洗酶標板。

Na2HP04·12H20 2.9 g, KH2PO4 0.2 g

NaCl 8.0 g, KCl 0.2 g

Tween20 0.5 m1 溶于1000 ml蒸餾水中。

10、脫激素(孕酮)奶(faqing牛奶通過由葡聚糖凝膠包被的活性炭吸附而得)

以5.0 g活性炭和0.5 g葡聚糖(G25)溶于250 m1不含BSA的測定緩沖液,磁力攪拌器攪拌30 min,成為用葡聚糖包被的活性炭(DCC)。取DCC一份,加等量奶樣,3000 r·min-1離心10 min,取上清液即為脫激素奶。

四、儀器與器材

聚苯乙烯板(酶標板),酶標測定儀,試劑瓶,微量加樣器及塑料吸頭(50 ul,200 ul,1000 ul),恒溫水浴鍋,水箱,磁力攪拌器。

五、實驗方法和步驟

1、酶標板的預處理 新制的酶標板含有有機成分,使用前先用無水乙醇浸泡二小時以上,再用蒸餾水沖洗干凈,37℃烘干或陰干。

2、制作孕酮抗血清稀釋度曲線及選擇孕酮抗血清工作濃度 將孕酮抗血清稀釋成不同濃度,包被同一酶標板的不同孔眼后,測其光密度,其目的選擇zui適抗血清稀釋工作濃度。隨著抗血清濃度的下降,光密度也隨之下降,一般初選光密度值為1.0左右時的稀釋度為孕酮抗血清的工作濃度(圖13.7-1)。

3、制作酶標孕酮稀釋曲線及選擇酶標孕酮工作濃度 以初選的抗血清稀釋度包被酶標板,將酶標孕酮稀釋成不同濃度,繪出酶標孕酮稀釋曲線(見圖13.7-2),選擇斜率zui大并有一定光密度值的稀釋度為工作濃度。

4、酶聯免疫分析的操作步驟 (按表13.7-1程序進行)

(1)加孕酮抗體 酶標板*縱列為空白,加包被液200μl作為參比孔,其他各列均加zui適稀釋度的孕酮抗血清200 u1稀釋好的抗血清,置4℃冰箱過夜。

(2)沖洗未吸附的游離抗體 取出包被28 h以上的酶標板。吸去孔內液體,用沖洗緩沖液洗三次,吸干。

(3)加待檢奶樣或標準孕酮 在空白孔和0標準孔中加100 ul去激素(孕酮)奶;其它標準孔中,每孔加100 ul標準孕酮;樣品孔中加5倍稀釋的脫脂奶樣100 ul。每個樣品至少有二個重復。

(4)加酶標孕酮 每孔加以所選zui適稀釋濃度的酶標孕酮100 u1。

(5)溫育酶標準板置37℃恒溫箱3 h。

(6)沖洗未結合的孕酮, 同(2)。

(7)顯色反應 每孔加200 ul新鮮配制的底物液,室溫放置45~60 min,或37℃30 min,讓其充分顯色。

(8)終止反應 每孔加50 ul 2 mol·L-1H2SO4,終止酶促反應。

(9)檢測 用酶標測定儀檢測波長450 nm處的光密度值(OD450)。

5、計算

測得樣品的OD值或結合率(占0管OD值的百分比),可從標準曲線上直接查到相的孕酮含量。

6、注意事項

(1)用于包被的抗血清濃濃度必須合適,過高就不存在結合的競爭性。

(2)奶樣中含有對測定的干擾物,因此標準品用脫激素奶樣稀釋,可以校正非特異性。

(3)免疫反應溫度不能超過40℃,不利于抗原抗體結合物的生成,且易使酶和抗血清的活性降低。一般37℃溫育3 h,38℃溫育2.5 h。

(4)所用微量加樣器,要求吸樣準確,應進行檢查校正。

六、實驗結果

繪制標準曲線圖,并報告樣品測定結果。

以上是乳中孕酮的酶聯免疫測定全部方法,如需咨詢關于孕酮ELISA試劑盒,咨詢我們。更有BIM品牌全新上市,期待中。。。。

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