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ELISA測試中所遇封閉與包被操作方法

發布時間: 2017-12-14  點擊次數: 598次

   封閉是否必要,取決于ELISA的模式及具體的實驗條件。并非所有的ELISA固相均需封閉,封閉不當反而會使陰性本底增高。一般說來,雙抗體夾心法,只要酶標記物是高活性的,操作時洗滌徹底,不經封閉也可得到滿意的結果。特別是用單抗腹水直接包被時,因其中大量非抗體蛋白在包被時同樣也吸附在固相表面,業已起到了類似封閉劑的作用。但在間接法測定中,封閉一般是不可少的。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中,在低溫可保存數月。
  包被用抗原或抗體的濃度,包被的溫度和時間,包被液的pH等應根據試驗的特點和材料的性質而選定??贵w和蛋白質抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液,也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后,在4-8℃冰箱中放置過夜,37℃中保溫2小時被認為具有同等的包被效果。包被的zui適當濃度隨載體和包被物的性質可有很大的變化,每批材料需通過實驗與酶結合物的濃度協調選定。一般蛋白質的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。

   封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程??乖蚩贵w包被時所用的濃度較低,吸收后固相載體表面尚有未被占據的空隙,封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙,從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質的再吸附。封閉的手續與包被相類似。zui常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白,也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑,其zui大的特點是價廉,可以高濃度使用(5%)。高質量的速溶食用低脂奶粉即可直接當作封閉劑使用,但由于奶粉的成份復雜,而且封閉后的載體不易長期保存,因此在試劑盒的制備中較少應用。

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