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TNF-α 誘導類風濕關節炎滑膜細胞NF-κB 信號通路活化的探討

發布時間: 2019-04-18  點擊次數: 494次

目的:研究TNF-α對類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)滑膜細胞NF-κB 信號轉導通路活化的影響。方法原代培養類風濕性關節炎滑膜細胞;應用Western blot 檢測滑膜細胞p65-NF-κB ΙκBα 蛋白的表達變化;應用免疫熒光技術分析NF-κB 核移位的變化。結果TNF-α 刺激不同時間后p65-NF-κB 蛋白在滑膜細胞核內表達增加,而在胞漿表達減少,30 min 時明顯;同時,免疫熒光顯示TNF-α 可促使NF-κB 向滑膜細胞核內移位;TNF-α 刺激20 min ΙκBα 蛋白降解明顯增加。

結論TNF-α 誘導類風濕關節炎滑膜細胞NF-κB 信號通路活化,可能與類風濕關節炎炎癥進程有關。

一、材料與方法

1)實驗材料:TNF-α試劑盒 (上海恒遠生物科技有限公司),PCNA 小鼠單克隆抗體(上海恒遠生物科技有限公司),GAPDH 小鼠單克隆抗體、NF-κB p65 兔多克隆抗體、IκBα 兔多克隆抗體(美國abcam 公司),Hoechst 33258(美國Sigma 公司),PVDF (美國Millipore 公司),FITC 標記的羊抗兔IgG (美國abcam 公司),DAB 顯色試劑盒(上海恒遠生物科技生物公司)。

2 滑膜細胞的分離和培養將關節置換術中所取下的新鮮RA 患者滑膜組織置于無菌的條件下剪碎,1 mg/ml 膠原酶37 下消化2 h,再加入0.2%胰蛋白酶37 下再消化30 min。離心收集細胞,加入含15% FCS DMEM 培養基,在5% CO2,37 的濕潤條件下貼壁培養,當細胞生長至融合時,用0.25%胰蛋白酶消化并按13 比例分瓶傳代培養。本研究使用滑膜成纖維細胞是410 傳代細胞。細胞純度為95%(CD3、CD11b、CD14、Von willibrand factor 陽性細胞比例均小于1%)。

3細胞處理和細胞核蛋白及胞漿組分的分離將細胞種于60 mm 培養瓶中,生長至85 %融合時,棄去培養液,換用含1%FCS 血清的DMEM 培養液培養24 h,分別加入TNF-α(20 ng/ml)作用不同時間。收集處理后的細胞,預冷的PBS 洗滌,1 000×g 離心1min,棄上清,沉淀加入400μl 預冷的緩沖液A(10mmol/LHEPES pH 7.9;10 mmol/L KCl;0.1 mmol/LEDTA;

0.1 mmol/L EGTA;1 mmol/L DTT;0.5 mmol/L PMSF)冰上靜置15 min 破壞細胞膜,加入25 μl 預冷的10% NP-40 混勻,渦流振蕩10 s,3 000×g 離心5 min,上清即胞漿蛋白組分。沉淀繼續加入50 μl 預冷的緩沖液B (20 mmol/L HEPES pH 7.9;0.4 mol/L NaCl;1 mmol/L EDTA;1 mmol/L EGTA;1 mmol/L DTT;1 mmol/L PMSF) 冰上靜置15 min 破壞核膜,4 12 000 g 離心10 min,上清即核蛋白組分。

4 Western blotting 分析將上述收集的上清液用Bradford 法測定總蛋白濃度。20 μg 蛋白與6×SDS 加樣緩沖液(187.5 mmol/L Tris-HCl, pH 6.8,6%SDS,30%甘油,150 mmol/L DTT,0.1%溴酚藍)混合,100 煮沸5 min。樣品經10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,電轉移法轉移到PVDF 膜上。室溫下封閉4 h ( 封閉緩沖液:2%白蛋白溶于TBST

(50 mmol/L Tris-HCl,0.15 mol/L NaCl,0.05% Tween20,pH 7.5),加入相應一抗,4 過夜。洗去一抗后,加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗,反應2 h。隨后用DAB 顯色,光密度掃描定量分析。

5細胞免疫熒光分析將細胞用0.25%胰蛋白酶消化,按1.0×105 個細胞分別接種于鋪有滅菌干凈蓋玻片的6 孔板中,于37 ,5% CO2 濃度的CO2 培養箱中培養,待細胞在玻片上長成單層時,取出玻片,PBS 清洗,多聚甲醛固定,0.1% Triton X-100 通透20 min,加入2% BSA 封閉30 min,加入一抗,4 過夜,洗去一抗后,加Cy3 標記的二抗,孵育45 min,加Hoechst33258 孵育2 min,雙蒸水清洗5 min,吸干,中性樹膠封片,熒光顯微鏡分析。

6統計分析采用SPSS 13.0 軟件包處理,計量資料以均數±標準差表示,多組間比較應用單因素方差(One-Way ANOVA)分析,方差齊采用SNK 方法,方差不齊采用秩和檢驗中的完全隨機設計多個樣本比較的Krudkal-Wallis H 檢驗。

二、結果

1 TNF-α p65-NF-κB 表達的影響Westernblotting 結果顯示:正常對照組中,p65-NF-κB 在滑膜細胞核中表達很少,而在胞漿中表達較多;TNF-α(20 ng/ml) 刺激不同時間15 min 后,p65-NF-κB 在細胞核中表達增多,而在胞漿中表達減少,這種變化在TNF-α 刺激30 min 時為明顯。

2TNF-α NF-κBP65核移位的影響應用免疫熒光細胞化學技術進一步分析了TNF-α (20 ng/ml)NF-κB (p65) 核移位的影響。在正常狀態,NF-κB(p65)位于滑膜細胞漿中,滑膜細胞受TNF-α 刺激后,NF-κB(p65)入核明顯增多,30 min 時為明顯。

3TNF-α ΙκBα 降解的影響Western blotting結果顯示,TNF-α (20 ng/ml) 刺激不同時間10 min后,胞漿中IκBα 表達明顯減少,TNF-α 刺激20 min時胞漿中IκBα 減少為明顯。但是,TNF-α 刺激60 min IκBα 又逐漸恢復。

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