TNF-α 誘導類風濕關節炎滑膜細胞NF-κB 信號通路活化的探討

目的：研究TNF-α對類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)滑膜細胞NF-κB 信號轉導通路活化的影響。方法原代培養類風濕性關節炎滑膜細胞；應用Western blot 檢測滑膜細胞p65-NF-κB 和ΙκBα 蛋白的表達變化；應用免疫熒光技術分析NF-κB 核移位的變化。結果TNF-α 刺激不同時間后p65-NF-κB 蛋白在滑膜細胞核內表達增加，而在胞漿表達減少，30 min 時明顯；同時，免疫熒光顯示TNF-α 可促使NF-κB 向滑膜細胞核內移位；TNF-α 刺激20 min 后ΙκBα 蛋白降解明顯增加。

結論：TNF-α 誘導類風濕關節炎滑膜細胞NF-κB 信號通路活化，可能與類風濕關節炎炎癥進程有關。

一、材料與方法

1）實驗材料：TNF-α試劑盒 (上海恒遠生物科技有限公司)，PCNA 小鼠單克隆抗體(上海恒遠生物科技有限公司)，GAPDH 小鼠單克隆抗體、NF-κB p65 兔多克隆抗體、IκBα 兔多克隆抗體(美國abcam 公司)，Hoechst 33258(美國Sigma 公司)，PVDF 膜(美國Millipore 公司)，FITC 標記的羊抗兔IgG (美國abcam 公司)，DAB 顯色試劑盒(上海恒遠生物科技生物公司)。

2 ）滑膜細胞的分離和培養將關節置換術中所取下的新鮮RA 患者滑膜組織置于無菌的條件下剪碎，1 mg/ml 膠原酶37 ℃下消化2 h，再加入0.2%胰蛋白酶37 ℃下再消化30 min。離心收集細胞，加入含15% FCS 的DMEM 培養基，在5% CO2，37 ℃的濕潤條件下貼壁培養，當細胞生長至融合時，用0.25%胰蛋白酶消化并按1：3 比例分瓶傳代培養。本研究使用滑膜成纖維細胞是4～10 傳代細胞。細胞純度為95%(CD3、CD11b、CD14、Von willibrand factor 陽性細胞比例均小于1%)。

3）細胞處理和細胞核蛋白及胞漿組分的分離將細胞種于60 mm 培養瓶中，生長至85 %融合時,棄去培養液，換用含1%FCS 血清的DMEM 培養液培養24 h，分別加入TNF-α(20 ng/ml)作用不同時間。收集處理后的細胞，預冷的PBS 洗滌，1 000×g 離心1min，棄上清，沉淀加入400μl 預冷的緩沖液A(10mmol/LHEPES pH 7.9；10 mmol/L KCl；0.1 mmol/LEDTA；

0.1 mmol/L EGTA；1 mmol/L DTT；0.5 mmol/L PMSF)冰上靜置15 min 破壞細胞膜，加入25 μl 預冷的10% NP-40 混勻，渦流振蕩10 s，3 000×g 離心5 min，上清即胞漿蛋白組分。沉淀繼續加入50 μl 預冷的緩沖液B (20 mmol/L HEPES pH 7.9；0.4 mol/L NaCl；1 mmol/L EDTA；1 mmol/L EGTA；1 mmol/L DTT；1 mmol/L PMSF) 冰上靜置15 min 破壞核膜，4 ℃下12 000 g 離心10 min，上清即核蛋白組分。

4 ）Western blotting 分析將上述收集的上清液用Bradford 法測定總蛋白濃度。將20 μg 蛋白與6×SDS 加樣緩沖液(187.5 mmol/L Tris-HCl, pH 6.8，6%SDS，30%甘油，150 mmol/L DTT，0.1%溴酚藍)混合，100 ℃煮沸5 min。樣品經10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電轉移法轉移到PVDF 膜上。室溫下封閉4 h 后( 封閉緩沖液：2%白蛋白溶于TBST

(50 mmol/L Tris-HCl，0.15 mol/L NaCl，0.05% Tween20，pH 7.5)，加入相應一抗，4 ℃過夜。洗去一抗后，加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗，反應2 h。隨后用DAB 顯色，光密度掃描定量分析。

5）細胞免疫熒光分析將細胞用0.25%胰蛋白酶消化，按1.0×105 個細胞分別接種于鋪有滅菌干凈蓋玻片的6 孔板中，于37 ℃，5% CO2 濃度的CO2 培養箱中培養，待細胞在玻片上長成單層時，取出玻片，PBS 清洗，多聚甲醛固定，0.1% Triton X-100 通透20 min，加入2% BSA 封閉30 min，加入一抗，4 ℃過夜，洗去一抗后，加Cy3 標記的二抗，孵育45 min，加Hoechst33258 孵育2 min，雙蒸水清洗5 min，吸干，中性樹膠封片，熒光顯微鏡分析。

6）統計分析采用SPSS 13.0 軟件包處理，計量資料以均數±標準差表示，多組間比較應用單因素方差(One-Way ANOVA)分析，方差齊采用SNK 方法，方差不齊采用秩和檢驗中的完全隨機設計多個樣本比較的Krudkal-Wallis H 檢驗。

二、結果

1） TNF-α 對p65-NF-κB 表達的影響Westernblotting 結果顯示：正常對照組中，p65-NF-κB 在滑膜細胞核中表達很少，而在胞漿中表達較多；TNF-α(20 ng/ml) 刺激不同時間15 min 后，p65-NF-κB 在細胞核中表達增多，而在胞漿中表達減少，這種變化在TNF-α 刺激30 min 時為明顯。

2）TNF-α 對NF-κB（P65）核移位的影響應用免疫熒光細胞化學技術進一步分析了TNF-α (20 ng/ml)對NF-κB (p65) 核移位的影響。在正常狀態，NF-κB(p65)位于滑膜細胞漿中，滑膜細胞受TNF-α 刺激后，NF-κB(p65)入核明顯增多，30 min 時為明顯。

3）TNF-α 對ΙκBα 降解的影響Western blotting結果顯示，TNF-α (20 ng/ml) 刺激不同時間10 min后，胞漿中IκBα 表達明顯減少，TNF-α 刺激20 min時胞漿中IκBα 減少為明顯。但是，TNF-α 刺激60 min 后IκBα 又逐漸恢復。