歡迎光臨上海勁馬ELISA試劑盒供應商(上海勁馬實驗設備有限公司)網站!
全國服務咨詢熱線:

13817140470

技術文章 / article 您的位置:網站首頁 > 技術文章 > ELISA試劑盒實驗原理、步驟以及問題分析

ELISA試劑盒實驗原理、步驟以及問題分析

發布時間: 2019-05-05  點擊次數: 475次

ELISA試劑盒實驗原理

酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)原理

1971年Engvall和Perlmann發表了酶聯免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent 

assay,ELISA)用于IgG定量測定的文章,使得1966年開始用于抗原定位的酶標抗體技術發展成

液體標本中微量物質的測定方法。

ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗

體仍保持其免疫學活性,酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性,又保留酶的活性。在測定

時,受檢標本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使

固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體,也

通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入

酶反應的底物后,底物被酶催化成為有色產物,產物的量與標本中受檢物質的量直接相關,故

可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。

由于酶的催化頻率很高,故可極大地地放大反應效果,從而使測定方法達到很高的敏感度

類型及步驟

ELISA的主要常用類型及步驟

1. 間接法測抗體

間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體(二抗)以檢測與固相抗原結合的

受檢抗體,故稱為間接法。操作步驟如下:

1)將特異性抗原與固相載體聯結,形成固相抗原,洗滌除去未結合的抗原及雜質。

2)加稀釋的樣本,保溫反應。樣本中的特異抗體與固相抗原結合,形成固相抗原抗體復合物。

經洗滌后,固相載體上只留下特異性抗體,樣本中的其他成份在洗滌過程中被洗去。

3)加酶標抗抗體。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗抗體結合,從而間接地標記上酶。洗滌后

,固相載體上的酶量與樣本中受檢抗體的量正相關。

4)加底物顯色。

2.競爭法測抗原

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點,因此不能用雙抗體夾心法進行測定

,可以采用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合。標

本中抗原量含量愈多,結合在固相上的酶標抗原愈少,zui后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物

等ELISA測定多用此法。

如何選擇合適的陽性對照?

陽性對照的基本組成應該盡量與檢測樣本的組成一致,一般陽性對照多以含蛋白保護劑的緩沖

液為基質,加入一定量的待檢物質。比如,以人血清為標本的測定,陽性對照多用確定的病人

血清或者以復鈣人血漿為原料加入一定量標準品。

如何選擇合適的陰性對照?

陰性對照的基本組成也應該盡量與檢測樣本的組成一致,先行檢測確定其中不含待檢物質

。比如,檢測人血清標本時,陰性對照應該選擇正常人血清;檢測免疫動物血清中抗體效價時,

陰性對照應該選擇該動物的免疫前血清。

如何選擇*化的包被條件?

1.包被抗原的選擇

包被抗原可分為天然蛋白、重組蛋白和小分子抗原三大類。天然蛋白需經純化才能用直接吸附

法包被,對于含雜質較多的抗原可以采用間接捕獲法包被(先用能夠與目的抗原反應的物質如抗

體直接吸附在酶標板上,再通過特異性反應使抗原固相化)。經純化的重組蛋白一般皆可直接包

板。小分子抗原比如多肽以及一些小分子有機化合物,由于分子量太小,往往難于直接吸附在

酶標板上,一般都先使其與無關蛋白質如BSA等偶聯,偶聯物吸附于固相載體上。

2.包被液的選擇

一般常用的是pH9.6的碳酸鹽緩沖液,如果包被的抗原在堿性條件下不穩定的話,也可以使用

pH7.2的磷酸鹽緩沖液。

3.包被溫度的選擇

通常是4-8度條件下過一夜或者37度保溫2小時,我們強烈建議4-8度條件下包被,有利于蛋白

活性的保持。

4.包被濃度的選擇

包被的zui適濃度隨固相載體和包被物的性質變化,一般蛋白質的包被濃度為1-5ug/ml,要明確

針對特定包被抗原的zui適包被濃度需要通過實驗來確定。

包板后需要封閉嗎?應該選擇什么樣的封閉體系?

封閉是否必要,取決于ELISA的模式及具體的實驗條件。一般說來,雙抗體夾心法,只要酶標

記物是高活性的,操作時洗滌徹底,不經封閉也可得到滿意的結果。而在間接法測定中,封閉

一般是*的。

常用的封閉劑有0.05%-0.5%的BSA、10%的小牛血清、1%明膠、5%的脫脂奶粉,AbMART推薦使

用5%脫脂奶粉,價廉而且封閉能力強,不過5%脫脂奶粉只適合短期內使用,不宜長期保存,所

以試劑盒中較少使用。

如何正確使用酶結合物?

1.酶結合物的稀釋液

在稀釋液中常加入高濃度的無關蛋白質(例如1%BSA或5%脫脂奶粉),通過競爭抑制酶結合物在

固相載體上的非特異性吸附。一般還加入能夠抑制蛋白質吸附于塑料表面的非離子型表面活性

劑,如吐溫20(0.05%的濃度較為適宜)。

2.正確稀釋酶結合物

酶結合物的合適工作濃度需要通過預實驗來確定,濃度過高易導致本底偏高,濃度過低則會導

致陽性信號的減弱。

酶結合物在使用前稀釋,稀釋后的酶結合物不宜長期保存,因為低濃度的酶結合物極易失

活。

問題/可能的原因/解決方法

1、問題:陰性對照產生了陽性的結果

  可能的原因:試劑或者耗材污染

  解決方法:更換試劑,使用一次性耗材

2、問題:洗板出現問題

  解決方法:更換更強配方的洗滌液,增加洗板次數,延長洗板時間

  (如果是在雙抗體夾心法中出現,有可能是包被抗體與二抗間有交叉反應,則要更換包被抗體或二抗)

3、問題:二抗產生了非特異性吸附

  解決方法:減少二抗使用量,縮短二抗反應時間

4、問題:顯色液不新鮮

  解決方法:使用現配的顯色液

5、問題:反應信號偏低

  可能的原因:包被條件不合適

  解決方法:提高包板濃度,延長包板時間

6、問題:梯度稀釋做ELISA時產生跳孔現象

  可能的原因:酶標板疊放導致傳熱不均勻,各孔反應溫度有差異

  解決方法:盡量避免酶標板疊放在一起

7、問題:移液器稀釋時未能保持連續性

  解決方法:定期校準移液器,確保移液器的正確使用

技術支持:安防展覽網   sitemap.xml   管理登陸
© 2021 版權所有:上海勁馬ELISA試劑盒供應商(上海勁馬實驗設備有限公司)( www.ninjatoes.com)   備案號:滬ICP備15015681號-5

聯系我們

contact us

咨詢電話

13817140470

掃一掃, 添加微信

返回頂部