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ELISA實驗常見問題及解決方法

發布時間: 2013-03-21  點擊次數: 811次
  ELISA試驗以靈敏度較高、特異性較好的特點在臨床上得到了廣泛的應用,但操作中的各個環節對試驗的檢測效果影響較大,如不注意,有可能導致顯色不全、花板等結果?,F將操作中各個環節常出現問題的原因及解決辦法總結于下,以期給同行帶來一些啟發,提高試驗質量。
  
  下面分析Elisa試驗操作中可能影響結果的原因,并給出相應的解決辦法。
  
  一、選擇試劑
  
  選擇質量優良的檢測試劑,嚴格按照試劑說明書進行操作,操作前將試劑在室溫下平衡30-60分鐘。
  
  二、加樣
  
  可能原因:
  
  1)血清或血漿標本分離不好即進行加樣;2)手工操作中,加樣板過多造成加樣后放入孵箱前等待時間過長(特別是室內溫度較高時);3)加完標本再加酶試劑時酶濺出孔外。
  
  解決辦法:
  
  1)標本為血清:將血液先自然存放1-2小時后,再用3000rmp離心15分鐘;標本為血漿:必須使用含抗凝劑的血液標本收集管,采血后必須立即顛倒采血管混合5-10次,放置一段時間后,3000rpm離心15分鐘;若在幾天內檢測,可放在2-8℃冰箱中,若要貯存,則置于-20℃的低溫冰箱內。2)加樣后及時放入孵箱。3)加酶試劑后用吸水紙在酶標板表面輕拭吸干。4)如果采用AT或其他全自動加樣,選擇FAME或其他后處理儀器加酶試劑。5)標本較多時,請分批操作。
  
  三、孵育
  
  可能原因:
  
  1)孵育時未貼封片或加蓋,使標本或稀釋液蒸發,吸附于孔壁,難于清洗徹底;2)孵育時間人為延長,導致非特異性結合緊附于反應孔周圍,難以清洗徹底。
  
  解決辦法:
  
  1)貼封片或加蓋;2)按說明步驟嚴格控制操作時間。
  
  四、洗板
  
  可能原因:
  
  1)采用手工洗板,孔與孔之間液體交叉。2)采用半自動洗板機洗板時,洗液量不足,導致洗板不徹底;洗板針堵塞,抽吸不完全;洗板不暢,導致洗板效果差。3)反應板過多造成洗板等待時間長。
  
  解決辦法:
  
  1)保證洗液注滿各孔,洗板針暢通,洗完板后在吸水紙(選擇干凈、無或少塵的吸水材料)上輕輕拍干;2)合理安排,或多用幾臺洗板機。
  
  五、顯色
  
  可能原因:
  
  1)顯色劑配制后放置時間過長或使用過期顯色劑;2)加顯色劑時濺出孔外造成液體回流。
  
  解決辦法:1)顯色劑盡量在臨用前配制,堅持不用過期顯色劑,肉眼可見淺藍色的TMB顯色劑不用;2)加樣時保持顯色劑不外流;3)A、B液應避免接觸金屬器械。
  
  六、終止
  
  可能原因如加終止液時產生較多氣泡,導致假陽性增加。所以在加終止液時應避免產生氣泡。
  
  七、讀板
  
  如讀板時板底不清潔等。應保證酶標板清潔。所以在整個操作過程中保證酶標板不接觸次氯酸;盡可能實現ELISA檢測標準自動化,有效提高檢測質量。
  
  在實際操作中,除了選擇優良試劑外,必須嚴格按照操作步驟進行操作,同時作好室內質控、室間質評,以嚴謹的工作作風檢測每一份標本,才能保證檢測質量?,F在國內已有相當數量的單位擁有全自動酶標儀,這對于實現ELISA標準化檢測、提高檢測質量起到了重要作用。
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