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雞腫瘤壞死因子αELISA檢測試劑盒說明

發布時間: 2013/1/4  點擊次數: 401次      文件下載    圖片下載    

試驗原理:

        TNF-A試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗(ELISA).已知TNF-A濃度的標準品、未知濃度的樣品 加入微孔酶標板內進行檢測。先將TNF-A和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后,加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌,去除未結合的酶結合物,然后加入底物A、B,和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中TNF-A的濃度呈比例關系。

 

elisa檢測試劑盒內容及其配制:

試劑盒成份

96孔配置

48孔配置

96/48人份酶標板

1塊板(96T)

半塊板(48T)

塑料膜板蓋

1塊

半塊

標準品:400pg/ml     

1瓶(1.0ml)

1瓶(0.5ml)

空白對照

1瓶(1.0ml)

1瓶(0.5ml)

標準品稀釋緩沖液

1瓶(8.0ml)

1瓶(4.0ml)

生物素標記的抗TNF-A抗體

1瓶(8.0ml)

1瓶(4.0ml)

親和鏈酶素-HRP

1瓶(12ml)

1瓶(5ml)

洗滌緩沖液

1瓶(20ml)

1瓶(10ml)

底物A

1瓶(6.0ml)

1瓶(3.0ml)

底物B

1瓶(6.0ml)

1瓶(3.0ml)

終止液

1瓶(6.0ml)

1瓶(3.0ml)

 

自備材料:

1.  蒸餾水。

2.  加樣器:5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。

3.  振蕩器及磁力攪拌器等。

4.

 

樣品收集、處理及保存方法:

 

1、 血清……操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后,1000×g離心10分鐘將血清

 

2、和紅細胞迅速小心地分離。

2、  血漿……EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。

3、  細胞上清液……1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4、  組織勻漿……將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘,取上清液。

 5、  保存……如果樣品不立即使用,應將其分成小部分-70℃保存,避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

 

操作注意事項:

 

●   試劑應按標簽說明書儲存,使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄,不可保存。

●   實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質。

●   不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。

●   使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物A、B液時,避免使用帶金屬部分的加樣器。

●   使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

●   底物A應揮發,避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感,避免長時間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。

●   加入試劑的順序應一致,以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。

●   按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

 安全性:

 

1.   避免直接接觸終止液和底物A、B,一旦接觸到這些液體,請盡快用水沖洗。

2.   實難中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

3.   不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

 

試劑的準備:

 

1.   標準品:標準品的系列稀釋應在實驗時準備,不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行:

400

pg/ml

(6號標準品)

原倍濃度不用稀釋直接加入50ul

200

pg/ml

(5號標準品)

100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液

100

pg/ml

(4號標準品)

100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液

50

pg/ml

(3號標準品)

100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液

25

pg/ml

(2號標準品)

100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液

12.5

pg/ml

(1號標準品)

100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液

0

pg/ml

(空白對照)

原倍濃度不用稀釋直接加入50ul

 2.   洗滌緩沖液(50×)的稀釋:蒸餾水50倍稀釋。

 試劑盒性能:

 

1.   靈敏度:zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990。

2.   特異性:不與其它細胞因子反應。

3.   重復性:板內、板間變異系數均小于10%。

 

操作步驟:

 

1.   使用前,將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫,以免加樣時加入大量的氣泡,產生加樣上的誤差。

2.   根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定,能使用復孔的盡量做復孔。

3.   加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板,輕輕振蕩混勻,37℃溫育45分鐘。

4.   甩去孔內液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復此操作4次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數增加一次。

5.   每孔加入100ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,37℃溫育30分鐘。

6.   甩去孔內液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復此操作4次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數增加一次。

7.   每孔加入底物A、B各50ul,輕輕振蕩混勻,37℃溫育5分鐘。避免光照。

8.   取出酶標板,迅速加入50ul終止液,加入終止液后應立即測定結果。

9.   在450nm波長處測定各孔的OD值。

 結 果 判 斷 與 分 析:

 1、  儀器值:于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值

2、  以吸光度OD值為縱坐標(Y),相應的TNF-A標準品濃度為橫坐標(X),做得相應的曲線,樣品的TNF-A含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應的濃度,再乘以稀釋倍數;或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數,即為樣品的實際濃度。

3、  檢測值范圍: 0-400pg/ml

4、  敏感度:1.0pg/ml


 

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